海洋植物プランクトンは、混合層が急速に浅くなるとコア光合成遺伝子と炭素貯蔵遺伝子を下方制御する

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メトリクスの詳細

海洋植物プランクトンは、光合成独立栄養生物の多様なグループであり、地球規模の炭素循環における重要なメディエーターです。植物プランクトンの生理機能とバイオマスの蓄積は混合層の深さと密接に関係していますが、混合層の深さの変化に応じて活性化される細胞内代謝経路については、まだあまり研究されていません。ここでは、メタトランスクリプトミクスを使用して、北西大西洋の晩春の 2 日間にわたる混合層の浅瀬（水深 233 メートルから 5 メートル）に対する植物プランクトン群集の反応を特徴付けました。ほとんどの植物プランクトン属は、システムが深い混合層から浅い混合層に移行し、急速な細胞成長を支える貯蔵炭素の異化作用に移行するにつれて、中核となる光合成、炭素貯蔵、および炭素固定遺伝子を下方制御しました。対照的に、植物プランクトン属は、この移行中に光化学系の集光複合遺伝子の多様な転写パターンを示しました。ウイルス対宿主転写物の比率として捉えた活性ウイルス感染は、混合層が浅くなると桿菌門（珪藻）門で増加し、緑藻門（緑藻）門で減少しました。私たちの発見に生態生理学的文脈を提供するために概念的モデルが提案されており、そこでは、一時的な深い混合中の統合された光制限と低い分割速度が、光合成、炭素固定、および炭素貯蔵に関連する資源主導の振動する転写レベルを混乱させるという仮説が立てられています。私たちの発見は、毎年北大西洋で開花する時期の一時的な深層混合と浅化イベントに関連する動的な光環境に順応する植物プランクトン群集内で共有され、独自の転写反応戦略が存在することを浮き彫りにしています。

植物プランクトンは単細胞の光独立栄養生物であり、乱流混合または対流によって均質化された海洋の最上部領域である表層混合層（ML）に季節的に蓄積することで、海洋領域全体の海洋食物網を支えています。季節的な植物プランクトンの発生は混合層の深さ（MLD）と密接に関係しており[1、2]、春の太陽光と暖かさの増加によりMLが浅くなり、植物プランクトンは冬よりも高い日射量にさらされ、その結果表面バイオマスが増加します。蓄積[1]。北大西洋では、植物プランクトンのバイオマスの年周期は、原核生物種と真核生物種の両方の一時的な変化を反映していますが、春の開花のクライマックスでは、バイオマスを支配するのは真核生物種です。この北大西洋の現象は、世界の海洋で最大のブルーム現象の 1 つであり、その年次周期は最近、北大西洋エアロゾルおよび海洋生態系研究 (NAAMES) で調査されました [3,4,5,6,7,8,9]。 NAAMES 研究では、物理的環境 (MLD の変化など) と、ブルームを支配する真核生物の植物プランクトンの群集構成および生態生理学との間の関連性が強調されています [4、5、7、10、11]。

これまでのフィールドワークでは、北大西洋におけるMLDの変化に対する大量の真核生物の植物プランクトン群集の反応が、数日から数か月の時間スケールで特徴付けられている[4、8、9、10、12]。春には、嵐が断続的に地表水を乱し、受光帯の下のMLDを深くし、その結果、下から栄養分がMLに補充され、植物プランクトンの成長が一時的に光が制限されます[10]。私たちは最近、春の終わりにバイオマスが蓄積しているときに、浅瀬になると、植物プランクトン群集が広範な酸化ストレス（酸化膜脂質、細胞内ROS、透明なエキソポリマー粒子生成）の兆候と積極的なウイルス生成を示すことを示しました[4]。春のクライマックス段階に続き、夏から秋にかけて ML はより強力かつ安定して成層化します。この長期にわたる層別化は、栄養素の欠乏、植物プランクトン濃度の減少、負の蓄積率、損傷した膜の兆候、死に関連するプロテアーゼ活性、ウイルス産生につながります。これらはすべて、捕食者/ウイルス濃度の増加やプログラムされた細胞などの植物プランクトン除去メカニズムの増加に関連しています。死[4]。

北大西洋で見られる2つの一般的な植物プランクトン分類群である珪藻と緑藻の実験室培養における動的光利用可能性に対する代謝反応も、ますます多くの研究によって特定されている[5、7]。これらの同じ分類群は、順応時よりも高い放射照度にさらされると、光保護に関与する LHCX などの特定の集光クロロフィルタンパク質複合体 (LHC) [13、14、15] を上方制御します [16、17]。アクセサリー顔料として [10]、酸化防止剤として [14]。珪藻と緑藻は、逆にコア光系遺伝子 [14、18、19、20] および他の LHC [13、14、15、21] を下方制御します。珪藻における多くの LHC タンパク質の細胞内配置 [22] と機能については研究がまだ解明されており、これらは強い光に反応して同じクラス内で上方制御および下方制御されるようである [13、14]。低光から高光への移行は、珪藻と緑藻の両方におけるバイオマス蓄積率の増加にも関連しています [15、23、24]。

植物プランクトンの in situ 転写状態を解釈する際に考慮すべき重要な要素は、光合成と細胞分裂に対する日照サイクルの影響です。受光域内に存在するのに十分に浅い安定したMLの野外研究では、真核生物および原核生物の植物プランクトン群集が、コア光系要素（光化学系IIサブユニットおよびATPアーゼ）、LHCのサブセット、および炭素固定をコードする転写物を上方制御することが示されている（カルビンサイクル）は夜から始まります。これらの遺伝子セットは、日の出から数時間後に最大転写レベルに達します[25、26、27、28、29、30、31]。逆に、酸化的リン酸化および脂質貯蔵分子（トリアシルグリセロール）に関連する転写は、日が沈むにつれて最高レベルに達し、夜を通して減少し[25、27、31、32]、細胞分裂をサポートします。 12 時間の光周期サイクルの下で成長させたモデル珪藻の実験室培養では、炭素貯蔵 (脂肪酸) 生合成転写が光周期の開始時に上方制御される一方、細胞分裂および DNA 複製遺伝子は下方制御されます [33]。これらのパターンは光周期の終わりまでに逆転し[33]、暗闇が始まるにつれて貯蔵された炭素の炭素エネルギー貯蔵利用への移行を反映している。これらの発見は、植物プランクトンは、植物プランクトンの毎日の積算日射量が少なくとも順応している日射量と同じくらい高い場合、コア光系構成要素への転写関与を減少させ、細胞分裂に備えて炭素を貯蔵し始めることを示唆している。

今回我々は、春の絶頂期にNAAMESステーションで急速（約2日）のML浅瀬化イベントが発生した際に、植物プランクトン群集に関連する特定の細胞内経路、遺伝子、ウイルス感染状態を特定した。常在の植物プランクトンは、深さ 233 メートルの MLD に取り込まれており、これは真冬の混合と大きな嵐システムの通過の名残です。 MLD は、表面放射照度 1% の深さとみなして、受光層 (51 m) より 180 m 深かった。その後、ML は 5 m まで浅くなり、光レベルの中央値は表面放射照度の 40% に相当しました。この同じ観測所での急速な浅化に対する大量の植物プランクトン群集の反応に関する以前の特徴付けでは、蓄積 [4、9]、光順化 [10]、捕食者/ウイルス [4、8]、貯蔵脂質 [4]、および酸化の観点から我々の研究を文脈化している。ストレス[4]。真核植物プランクトン (直径 1 ～ 20 μm) の細胞濃度は、深層 ML と比較して浅層 ML の表層水で増加しました [4, 10]。これは、この浅瀬化現象が細胞の急速な分裂を誘発したことを示しています。蓄積には、付属色素と光化学系断面積の増加、植物プランクトンバイオマスあたりの光化学系 II (PSII) 反応中心の数、および真核植物プランクトンの細胞あたりの総クロロフィル蛍光の減少などの光順化プロセスが伴いました [10]。浅い混合層では細胞内の脂質貯蔵量が増加しました[4]が、ROS、酸化膜脂質、細胞あたりの透明エキソポリマーなどの酸化ストレスバイオマーカーは一貫したパターンを示さなかった[4]。これは、コミュニティにおける混合酸化ストレス反応を示唆しています。。同時に、捕食者（草食動物とウイルス）の総数が増加する一方で、遊離ウイルス：細胞の比率が減少し[4、8]、植物プランクトンの増殖と捕食者の存在量が一時的に切り離されることが可能になりました。

我々は、このステーションでの群集パラメータの広範な観察を、低光量に順応した植物プランクトンが高光曝露にどのように移行するかについての前述の理解と組み合わせて、急速なML浅化に対する常在真核生物植物プランクトンのメタトランスクリプトーム応答の解釈枠組みを構築しました。我々は、植物プランクトンが光制限（深いML）状態から光飽和（浅いML）状態に移行すると、コア光系遺伝子とカルビン回路遺伝子が下方制御されるが、カロテノイド、酸化剤消去タンパク質、炭素貯蔵（トリアシルグリセロールやトリアシルグリセロール、複合炭水化物）、および特定の光合成 LHC。このステーションの最近浅くなったMLコミュニティに関連する急速な植物プランクトンの蓄積とバルクウイルス：細胞比が低いことを考慮すると[4]、我々はさらに、常在細胞内の活発なウイルス複製が深いMLコミュニティと比較して減少し、ウイルス圧力が除去され、細胞がより急速に蓄積します。

我々は、晩春の北大西洋における植物プランクトンバイオマスの年間ブルームサイクルの最高段階（2016年5月24～26日）に急速な成層現象を観察した[3、4、8、10]。サイト占領時 (NAAMES II [3] のステーション 4)、植物プランクトンのバイオマスは他の季節段階と比較して北大西洋全域ですでに高く、引き続き積極的に蓄積し続けていました [4, 9]。この季節的な開花期の植物プランクトンの個体数は、嵐の通過に関連してエピソード的な ML の深化とその後の層化を日常的に経験します（補足図 1 および補足表 1）。これは、上部 ML がまだ深層水からわずかに区別されているだけであるためです [4、34、35]。ステーションに到着すると、塩分と温度に基づく密度勾配によって決定されるように、水柱は深く混合されました（補足図2B、C、および図1A）。クロロフィル A 濃度も均一に分布しており、活発に混合された層またはごく最近混合された層を示唆しています (補足図 2H、補足表 2)。この観測所のケーススタディでは、5 月 24 日に高気圧渦の中心内でサンプルを採取し、5 月 26 日にはこの渦の周縁内にいたことが明らかになりました [36, 37]。私たちのサンプリング戦略は、近くの光学プロファイリングフロートをガイドとして使用して、この高気圧渦内のMLD（および関連する光レベル）の変化に対する植物プランクトン群集の転写応答を捕捉することでした（補足図1、「metbio003d」[3、4、10]） ]）。

混合層深さ (MLD) に関連したサンプリングプロファイル。白丸 (1 ～ 6) は、メタトランスクリプトーム分析のためにサンプリングされた深さと時間を表します。それらは、以前に発表された一連の生理学的マーカーに対応します [4]。黒丸と折れ線グラフは、船舶および光学式フロートプロファイラーに基づいて混合層の深さを表します (色分けされています。キーを参照)。 B 船上測定から得られた海面光合成活性放射線。(A) の時間と一致。 PAR 時系列の各データポイントは、可視波長 (400 ～ 700 nm) にわたる毎日の積分広帯域放射照度です。 C 対象の分類群にマッピングされた生 RNA リードの割合。これには、顕著な光独立栄養門 [桿菌門 (珪藻)、緑藻門 (緑藻)、渦鞭毛藻門、およびハプト植物門 (ハプト植物)] が含まれます。色付きの円は三重を示します。 D 上位 20 は、サンプルごとの合計 TPM に基づいた属を表しました。各色付きの円は、(A) のサンプル 1 ～ 6 の 1 つの 3 つを表します。箱ひげ図は中央値 ±1 四分位を表します。 E Bacillariophyta (x5)、Dinophyta (x2)、および Chlorophyta (x3) 門の上位属の転写応答。各行は、差次的に発現すると判定された固有の遺伝子を表します (調整済み p 値 < 0.001、log2 倍率変化 > |1|)。各列は、(A) からのサンプルの 3 つを表します。 Z スコア、行の順序、および列のグループ化は、ペアごとの完全な観測値とピアソン係数を使用して、遺伝子発現の分散安定化変換から構築された相関行列に基づいています。ノードは、100 ブートストラップ (n = 1000、平均法、相関距離行列、ペアごとの完全な観測値) 未満であった場合にのみラベル付けされます。 F 有意に変化した遺伝子の属別の割合（調整済み p 値 <0.001、log2 倍数変化 > |1|）。「1V2」、「1V3」、「2V3」などは、(A) のサンプル番号の比較を指します。

光学プロファイリングフロートに基づいて、私たちのステーション占領地から約61キロ離れたところに水が到着の少なくとも2日前に深く混合されていたと推定しています。 (図1A)。ステーション占領中のMLDは、5月24日を通じて地表から233メートルまで広がり、5月25日の～15時までに浅瀬まで5メートルまで広がり、植物プランクトンは、～22時にPARが10μmol光子m2 s−1未満に減少するまで、より高い日射量にさらされた。 :00 時間 (図 1A、B)。この浅い MLD は、残りのサンプリング期間を通じて持続しました (図 1A)。現在の研究中に観察されたものと同様の空間的および時間的スケールでの急速なMLの浅化と深化（72時間以内に100 m MLDを超えるから25 m MLD未満）は、北西大西洋の一部の地域で年に数回発生する可能性があります（補足表1、補足表1、補足図1)。これらの急速な浅瀬化と深化現象は、この地域では11月から5月にかけて最も頻繁に発生します（補足図1）。

統合された表面 PAR レベルは、サンプリング日の前の日（5 月 23 日と 5 月 25 日、補足図 2A）で同様でした。これらの累積光レベルは、夜明け前に収集された細胞における植物プランクトン群集の転写に影響を与えると予想されます。占有中、積分表面 PAR はわずかに減少しました (図 1B)。浅いMLでは中程度の主要栄養素の低下が観察されましたが（補足図2D–G、補足表2）、成長制限レベルまでではありませんでした。この適度な栄養素の減少は、浅いML内のクロロフィルAと後方散乱[10]の増加を伴い、両方とも植物プランクトンバイオマスの代理でした（補足図2H）。すべての色素に対する光合成色素の比率は減少し（補足図2Iおよび補足表2）、これはコミュニティ全体が光防御の増加に向けて移行していることを示唆しています[10]。

我々は、真核生物の植物プランクトン群集のメタトランスクリプトームを分析して、層別事象に対する植物プランクトンの細胞内応答を評価しました。受光ゾーン内の細胞ポリアデニル化 mRNA (以下、mRNA と呼びます) の分類学的組成は、2 つの夜明け前のサンプリング日の間で類似していました (方法を参照、図 1C)。上位 3 つの代表的な単細胞光合成分類群は、Bacillariophyta (珪藻)、Dinophyta (渦鞭毛藻)、および Chlorophyta (緑藻または緑藻) でした (図 1C)。すべてのサンプルで最も豊富な珪藻 mRNA は、鎖を形成できる中心珪藻である Minutocellus 由来のもので、次に Extobocellulus と Fragilariopsis が続きました (図 1D)。最も代表的な緑藻はミクロモナス属、バティコッカス属、およびオストレオコッカス属であり (図 1D)、これらは一般に同じ群集の 16S rRNA 配列と一致します [11]。真核生物の植物プランクトンの細胞体積[38]、細胞あたりのRNA含有量[39、40]、ゲノムサイズ[41]は桁違いに異なる可能性があるため、mRNAの分類分布はバイオマスの存在量を反映していない可能性があります。渦鞭毛藻は群集 mRNA のかなりの部分に寄与していましたが、層別化に応じて 2 日間のサンプリング枠内で差次的に発現された遺伝子の割合は比較的低かった (図 1F)。これは、十分に文書化されている、翻訳後制御を支持する転写応答のミュートを反映している可能性があります [42、43、44]。さらに、それらは純一次生産性が高い海洋域で混合栄養性の転写戦略を示すことが知られており[45]、光順化の観点からの解釈分析が複雑になっている。したがって、我々は、独立栄養性珪藻および緑藻分類群内の光合成、炭素固定、炭素貯蔵および感染状態に関連するML浅化に対する応答に焦点を当てた。

最も豊富な植物プランクトン属の全体的な転写プロファイルは、MLD と非常に密接に関連していました (図 1E、F)。異なる光レベルとMLD間の転写物を比較したところ、同じMLD内の異なる光レベルと比較して、異なるMLDと同じ光レベルの間で差次的に発現される遺伝子の割合が高いことがわかりました（図1E、F）。最も豊富な 2 つの属、Minutocellus と Extobocellulus は、深部 ML と浅部 ML の間で差次的に発現される遺伝子の割合が最も多く (図 1F)、検出された転写産物の 20 ～ 30% を変化させました。これは、他の珪藻や緑藻よりも約 1 桁多く、渦鞭毛藻属よりも約 2 桁大きかった (図 1F)。対照的に、トランスクリプトームには、深層ML内のほとんどの属について、異なる光レベル間で差次的に発現される遺伝子が少なく含まれており（図1E、F）、これは活発な混合を示しています。混合に対する物理的障壁 (ピクノクリン) を反映して、層別 ML の上下から収集したサンプル間で中程度の差次的な遺伝子発現が検出されました。 (図1E、F)。

植物プランクトンと細菌群集の組成が、5 月 24 日と 5 月 26 日に同じ観測所で収集された他のデータ (図 1C) と類似していること [7、10、46]、および高気圧渦内でのサンプリングを裏付ける前述の物理データを考慮すると [36] 、３７]、観察された差次的遺伝子発現パターンは、水柱の層別化に関連した放射照度の変化に対する同じコアコミュニティメンバーの反応を表している可能性が最も高い。私たちがステーション占有地にわたって同じ中心群集をサンプリングしたという考えは、地球化学的測定によってさらに裏付けられています。海洋藻類および細菌群集によって放出される化学物質であるジメチルスルフィド[47、48]は、このステーションで植物プランクトンのバイオマスが増加するにつれて徐々に増加しました[49]。層別化に応じて同じ微生物群集に由来する生産を主張する。 ML の浅瀬化の急速なタイムスケールが観察されたため、我々は、サンプリングしていた高気圧渦内でより暖かい水がより冷たい深く混合した水を横方向に移動させて [36, 37]、5 月 26 日の ML の浅瀬化に寄与した可能性があることを認めています。このような側方伝達が起こった場合、転写応答は、これらの生物が層別化に応答するために使用する正確な時間スケールを表していない可能性があります。それにもかかわらず、我々のデータは、動的MLDに本質的に関連する光環境の変化に対する一般的な細胞内植物プランクトンの反応を明らかにしています。

MLD が浅いほど、1 日の積算露光量が高くなるため、LHC の発現とコア光合成タンパク質に対する LHC の比率を調査しました。珪藻と緑藻は、急速な層化に応じて一連の LHC を異なって発現しました (図 2)。我々は、フコキサンチン-クロロフィル結合タンパク質、またはFCPとも呼ばれる340の固有の珪藻LHC転写物を同定した[50]（補足図3）。タラシオシラ属内で固有のLHC転写物の量が最も多い（補足図4）。最近の研究に基づいて、我々は LHC のさまざまな上方制御と下方制御の両方を予想しました [16、17、51]、その役割はまだ解読中です [50、51、52、53]。深い MLD から浅い MLD まで収集されたサンプルを比較すると、3 つの LHC 転写パターンが明らかになりました。最初のパターンは、ミヌートセルス属、エクストボセルルス属、およびチェトセロス属の間で共有されており、深層MLと浅層MLの両方で一連のLHC遺伝子を高度に発現していました（図2）。 2番目のパターンは、タラシオシラとバチコッカスの間で共有されており、深いML内で一連のLHC遺伝子を高度に発現しましたが、浅いML内では下方制御しました（図2）。異なる門に由来するこれら2つの属の間の転写パターンの収束は、集光複合体のアミノ酸類似性と相関していませんでした（補足図5）。 3番目のパターンはフラギラリオプシスによってのみ採用されており、浅いML内の深さ5 mで一連のLHC遺伝子を最高レベルで発現しました（図2）。

各遺伝子の相対発現を反映するために行ごとに正規化されたクロロフィルタンパク質複合体 (LHC) の正規化リードカウントのヒートマップ (スケールバーを参照)。各行は固有の転写物を表し、ヒートマップの各列は、異なる混合層深さ（5 月 24 日は 233 m、5 月 26 日は 5 m、図 1A）の受光ゾーン内の 3 つのサンプルを表します。次の 3 つの列は、その転写物が水柱内で深く混合された層 (「深い MLD」)、浅い混合層 (「浅い MLD」)、または同じ光レベルからの水柱間で差次的に発現されたか (黒いバー) を示します。 40%、20%、または 1% の相対表面放射照度、「層別」)。推定上の集光複合体遺伝子名は右の次の列にリストされており、属名は右の最後の列に示されています。広範な分類群ラベル (珪藻、緑藻) が右端に示されています。

急速なML浅化に対するさまざまなLHC転写戦略は、動的な光が利用可能な環境での増殖を可能にする、種内の多機能LHCタンパク質および/または各属内の異なる種の応答を反映している可能性があります。いくつかの研究では、一部の培養珪藻種におけるさまざまな LHCX および LHCF タンパク質が、強い光への曝露に応答して上方制御および下方制御されることが記載されており [54]、これは異なる役割と応答を反映している。 LHCX タンパク質のサブセットは、内腔 pH が低下すると励起子を消光色素に移動させる能力を増加させます [55]。これにより、各属内で独自の遺伝子発現フィードバックが引き起こされる可能性があります。さまざまなタラシオシラ種は、低光量から高光量に変化してから数時間以内に、補助色素とクロロフィルの比率を増加させることが示されています[56]。 LHC タンパク質はこれらのアクセサリー色素に結合するため、LHC 遺伝子発現も強い光にさらされた数時間以内に変化する可能性があると推測するのは論理的です。前述した水塊の側方移動の可能性は、不均一なコミュニティを導入することによって観察された属内 LHC 転写変動に寄与した可能性があります。

LHCからコア光合成タンパク質への電子の流れを追跡し、次にLHCとコア光合成遺伝子（光化学系IおよびIIサブユニット、シトクロムb6/f複合体、光合成電子輸送およびF型ATPアーゼ）の比率の転写パターンを比較し、光順応を明らかにした。 ML シャローイングに対応する戦略。２つのパターンが出てきました。分析した5つの珪藻属のうち4つ（ミヌートセルス、エクストボセルルス、フラギラリオプシス、チェトセロス）では、LHC：コア光合成転写産物の比率が浅いMLで増加しました（図3A）。タラシオシラ sp. 一方、緑藻分類群は、ML 層別化に応じて LHC:コア光合成転写産物の比率を変化させませんでした (図 3A)。 LHC転写の属間の違いは、LHCタンパク質の機能の違い（すなわち、光子収集または光保護）、または属間の光収集戦略の違いを反映している可能性があります。たとえば、バチコッカスは浅いML内およびその下のすべてのLHCを下方制御しましたが、チェトセロスのLHC発現は浅いML内でより高く、浅いMLの受光ゾーンで光が減少するにつれて徐々に下方制御されました（図2）。これは、珪藻よりも遅く、より構成的で安定したバチコッカスや他の緑藻類の蓄積戦略を反映している可能性があり、通常、培養中で倍増するのは 1 日に 1 回未満である [57]。対照的に、Chaetoceros が採用するより迅速かつ動的な戦略は、強い光の存在下ではるかに高い成長速度をサポートし、細胞が 1 日に 2 回以上分裂する可能性を可能にします [58]。日中光強度が増加するにつれて、夜明け前のLHC転写で観察された差異が属間で収束するのか、それともさらに発散するのかを明らかにするには、追加の時間分解研究が必要である。

A. バーの高さは、さまざまな分類群 (右端の属) の LHC: コア光合成転写産物の最高の 3 つの比率を表します。点は、各 3 つのサンプルからの TPM 比を表します。 AおよびBの各列の位置は、異なる混合層深さ（図1Aから、上軸に示されている）内の相対表面放射照度（40％、20％、1％表面放射照度）に対応するサンプルを表します。 B. バーの高さは、3 つの TPM の平均から決定された、異なる分類群 (右端の属) の各コア光系遺伝子クラス (異なる色で示されている) の相対的な転写物存在量を表します。 PSII 転写物の相対的な寄与は一般に SLM で最も低いことに注意してください。

LHC の転写戦略には属間で大きなばらつきがありましたが、総 LHC とコア光合成の転写産物の比率、および LHC サブタイプは、属全体でより統一された傾向を示しました。また、PSII転写産物と他のコア光合成転写産物の相対比が、急速な層化に応じてほぼすべての属にわたって減少したことにも注目しました（図3B）。さらに、異なるLHCサブタイプをコードする転写物の比率は、両方のMLD内でほぼ同じでした（補足図6）。

いくつかの例外を除いて、複数の植物プランクトン属にわたって層別化すると発現が下方制御されるため、コア光系遺伝子のパターンは一般に我々の仮説を支持しました。 PSII のいくつかの遺伝子 (psbO、psbQ) は、珪藻の最近浅くなった ML の 40% 放射深度で比較的高度に転写されました (図 4)。深層ML内では、1つのコア光合成遺伝子（タラシオシラのpsbQ）のみが差次的に発現されました（図4）。コア光系遺伝子の下方制御と他のコア光系遺伝子に対するPSII遺伝子の比率の低下は、より高光環境でコア光系を通る電子の流れを制限することを目的とした光順化戦略を示唆している。この研究の層別ML内の集団からのコア光化学系遺伝子の下方制御は、最初の24時間で低光から高光に移行した植物プランクトン培養によって裏付けられている[14、59]。これは、前日（5月25日）の約15時までにMLDが浅くなり、PARが10μmol光子m2 s−1未満に減少した約22時まで地域社会がより高い日射量にさらされることと一致します（図1A、B））。安定した成層環境では、さまざまな植物プランクトン分類群が正午までにコア光系遺伝子を下方制御する[25、26、27、28、29]。この戦略が採用される理由の 1 つは、過剰な光子と急速な酸素の生成が酸化損傷を引き起こす可能性があるためです [60、61]。したがって、我々は分析を拡張して、非光化学消光 (NPQ) [13] とオキシダント消去を通じてこれらの酸化効果を軽減できるタンパク質をコードする遺伝子の変化を評価しました。

各遺伝子の相対的な発現を反映するために行ごとに正規化された正規化リード数のヒートマップ (スケールバーを参照)。各行は固有の転写物を表し（属ごとに色分けされています。キーを参照）、ヒートマップの各列は、異なる混合層の深さ（5 月 24 日は 233 m、5 月 26 日は 5 m、図 1A）の受光層内からの 3 つの転写物を表しています。次の 3 つの列は、その転写物が深く混合された層 (「Deep MLD」) または浅い混合層 (「Shallow MLD」) の水柱内で、または同じ光レベル (40 %、20%、または 1% の相対表面放射照度、「深い対浅い」)。推定上のタンパク質名は右の次の列にリストされ、遺伝子モジュールまたは経路は最後の列に示されています。

色素比のバルクコミュニティの変化（補足図2I）に基づいて、保護LHCXタンパク質、カロテノイド、および抗酸化酵素をコードする多数の遺伝子が発現の大幅な増加を示すと予想されました。 LHCX タンパク質とその中に含まれるカロテノイドは、強い光にさらされたときに過剰な励起子エネルギーを消光することが示されています [16]。私たちの仮説に反して、コミュニティ全体で検出されたカロテノイド生合成およびオキシダント消去遺伝子の大部分は、さまざまなMLDの夜明け前のサンプリング中に差次的に発現されませんでした（補足図7）。一部のオキシダント除去遺伝子とカロテノイド生合成遺伝子は深いMLでより高度に発現しましたが、他の遺伝子は浅いMLで、または単一の光強度でさえ高度に発現しました（図5）。光保護機能のみを持つカロテノイドは例外であり、これらの遺伝子の小さなグループが、深く混合された水柱中でいくつかの属（ミヌートセルス、チャエトセロス、バチコッカス）で一貫して上方制御されていたためです（図5）。これは、深層ML内で経験される一時的な照明に特有の分類群特有の光防御反応を示している可能性があります。

各遺伝子の相対的な発現を反映するために行ごとに正規化された正規化リード数のヒートマップ (スケールバーを参照)。各行は固有の転写物を表し（属ごとに色分けされています。キーを参照）、ヒートマップの各列は、異なる混合層深さの受光層内からの 3 つのデータです（5 月 24 日は 233 m、5 月 26 日は 5 m、図 1A）。次の 3 つの列は、その転写物が、深く混合された層 (「Deep MLD」) または浅い混合層 (「Shallow MLD」) の水柱内で、または同じ光レベルからの水柱間で差次的に発現されたか (黒いバー) を示します。 40%、20%、または 1% の相対表面放射照度、「層別」)。推定上のタンパク質名は右の次の列にリストされ、遺伝子モジュールまたは経路は最後の列に示されています。

広範なカロテノイド生合成反応が欠如し、中程度の抗酸化反応のみであることには、複数の説明がある可能性があります。 1つの説明は、カロテノイドと抗酸化物質の上方制御は夜明け前に抑制されており、これらの分子の代謝回転の増加が必要な日中に増加したであろうというものです。この説明は、この研究で使用された比較では検出されたものの、差次的に発現されなかった保護機構に関連する多数の転写物によって裏付けられています（補足図7）。このことは、日の出後のカロテノイド転写の増加 [62]、強い光にさらされた 1 時間以内の珪藻 NPQ [13, 16, 54, 56] および LHCX 転写 [63, 64] の増加の観察によってさらに裏付けられています。カロテノイド生合成のために上方制御される遺伝子が欠如していることの別の説明は、フコキサンチンとジアジノキサンチンの生合成経路が完全にマッピングされておらず[14]、その結果、我々の分析で見逃されたというものです。

植物プランクトン個体群の炭素貯蔵と中心炭素転写物から、浅いMLでの急速に分裂する成長状態と比較して、深いMLではエネルギーが節約された代謝が明らかになりました。同化炭素代謝に関与する転写物は、一般に深層MLで上方制御されていました。珪藻は一般に、浅瀬MLにおいて脂肪酸合成遺伝子を下方制御し、脂肪酸異化遺伝子を上方制御しましたが、例外はGYG1/GYG2、ACSF3、およびfabG/OAR1をコードする転写物でした（図6）。緑藻は、深く混合された水柱中で複合炭水化物合成遺伝子を均一に上方制御し、炭水化物分解遺伝子を下方制御した（図6）。珪藻は、炭水化物の合成および分解転写物の発現に大きなばらつきを示しました（図6）。バチコッカス属で最も多くのユニークな炭素エネルギー貯蔵遺伝子を検出しました（補足図8）。これは、MLDに関連した複雑な炭水化物管理にとって重要な役割を示唆しています。ほとんどの植物プランクトン分類群は、MLの浅化時にペントースリン酸経路（PPP）の上方制御を介して、中央の炭素代謝をNADPH生成の増加に向けてシフトしました（補足図9）。我々は、複合炭水化物とPPPの異化に対するこの転写の関与により、細胞が増殖速度の増加をサポートして核酸や他の細胞成分の生合成能力を高めることができると主張します（図6および補足図9）。逆に、炭素貯蔵遺伝子とカルビンサイクル遺伝子の上方制御により、深層MLの光が制限された環境で細胞がエネルギー効率を最大化できるようになります（図6および補足図9）。

すべてのサンプルにわたる、選択した単細胞植物プランクトン属からの正規化リード数 (DESeq2) のヒートマップ (色分け、キーを参照)。各遺伝子の相対的な発現を反映するために行ごとにさらに正規化されています。各行は固有の転写物を表し (スケールバーを参照)、ヒートマップの各列は、異なる混合層深さ (5 月 24 日は 233 m、5 月 26 日は 5 m) の受光層内からの 6 つのサンプルの複製です。次の 3 つの列は、その転写物が深く混合された層 (「Deep MLD」) または浅い混合層 (「Shallow MLD」) の水柱内で、または同じ光レベル (40 %、20%、または 1% の相対表面放射照度、「層別」)。推定上のタンパク質名は右の次の列にリストされ、遺伝子モジュールまたは経路は最後の列に示されています。

浅いMLの植物プランクトン集団は、バルククロロフィルA（補足図2H）と細胞濃度[4]の急速な増加を示し、バイオマスあたりのクロロフィル蛍光の減少[10]を示し、光の増加が刺激効果を持ったことを示唆していますカーボンの固定について。カルビンサイクル遺伝子が浅いMLで下方制御されていることを考えると、これはいくぶん直感に反します（補足図9）。ただし、カルビン回路遺伝子の下方制御は、いくつかの理由で発生した可能性があります。一つの説明は、カルビン回路遺伝子の発現は、地表水と短時間混合されたときに炭素固定と炭素貯蔵同化経路を最大化するために、深部MLの日中の光レベルが低い間に構成的に刺激された可能性があるということである（図6）（つまり、「干し草を作りながら、太陽が輝いている」）[65]。この考えは、植物プランクトンがカルビン回路遺伝子を下方制御し、より速い成長に必要な核酸やその他の細胞成分の生合成のために中心炭素代謝をNADPH前駆体にシフトさせるために数時間の太陽光を必要とするという以前の研究[25、26]と一致している。あるいは、カルビン回路の下方制御は、ウイルス防御戦略 [66、67] またはウイルスによる宿主代謝の変化 [68、69、70、71] である可能性があり、浅瀬内の一部の珪藻群で観察されるウイルス：宿主比の増加を考慮すると、これらは論理的です。 ML (以下を参照、図 7)。

棒グラフの高さは、受光ゾーン内の異なる相対表面放射照度および異なる混合層深さにおける集団の総宿主 TPM に対するウイルス遺伝子 TPM の平均比 (三重実験から) です (上部の x 軸ラベルを参照)。 Y 軸のスケールが異なることに注意してください。バーは、各推定上の遺伝子クラスの平均比率で塗りつぶされています (色分けされています。キーを参照)。ウイルス遺伝子は、他のウイルス遺伝子に最も近い NCBI 一致 (補足表 3)、およびこれらの遺伝子の翻訳されたアミノ酸配列と推定機能 (補足表 4) に基づいてフィルタリングされました。推定上のマルナウイルス（珪藻感染ウイルス）グループは系統樹によって決定されました（補足図10）。

私たちの以前の研究では、ML の浅化によりバルクウイルス：細胞比の減少が報告されたことを考慮して [4]、ML によって誘発される中心代謝変化が属を超えた活動性ウイルス感染の転写マーカーに反映されているかどうかを調べるためにコミュニティを調査しました。門全体の観点から見ると、珪藻は一般に、ML が浅くなるとさらなる感染のトランスクリプトーム証拠を示しましたが、緑藻は感染のより低い分子サインを示しました（図 7、8B）。先行研究[72、73]に基づく我々の方法論的根拠は、細胞内ウイルス転写物と宿主転写物の相対比から感染の程度を推測できるというものであった。私たちのサンプルは孔径 0.8 µm のフィルター上に収集されたバイオマスで構成されており、読み取りはポリアデニル化転写物から濃縮されているため、検出されたウイルス転写物は主に細胞内の発現 (および複製) に関連していることに注意してください。ウイルス読み取りの一部が、サンプリング中に細胞とともに孔径 0.8 μm のフィルター上に収集された細胞外の遊離ウイルス粒子に由来する可能性はありますが (可能性は低いですが)。

この研究で遭遇した過渡混合の概念図。水色は有光ゾーンの深さを示し、濃い青は光合成活性放射が表面値の 1% 未満である深さを示します。矢印のサイズは、この研究で分析された混合層の深さを示します。それぞれの深い ML 条件と浅い ML 条件は、光が制限された条件または光が豊富な条件に関連付けられていることに注意してください。 B 光子収集、光合成、中心炭素代謝、およびウイルス感染に関連する経路 (行) の遺伝子発現の門レベル (珪藻、緑藻) 解析 (詳細はメソッドを参照)。ボックスには、深い ML 内のサンプル (相対表面光 40%、20%、および 1%) に対する浅い混合層内のサンプル (相対表面光 40%) 間の log2 倍数変化が表示されます。色は、TPM 比の中央値 (「ウイルス感染」) または差次的に発現された転写産物の中央値 (残りのカテゴリー) によって影付けされています。「光合成電子流」と「中心炭素代謝」は、門間の共有転写応答を構成する同じ全体的な方向性を持ち、(C) で使用されるカテゴリーに情報を与えます。 C 私たちの研究と同様のマーカーを使用した以前のフィールド研究からの発現データに基づいて、ML の深化がコア遺伝子クラスの振動するディール転写パターンをどのように中断するかを示す提案された概念モデル (カラーキーを参照) [25、26、31]。上のパネルは、安定した浅い混合層内で観察された転写パターンを表しており、これにより、コア遺伝子セットの発現の相対レベルは、日光曝露または暗闇の数時間後に変動する[25、26、30、31]。下のパネルは、受光域を超える深層MLに関連する積分太陽光曝露量の低下により、遺伝子セットがそれぞれ高転写レベルと低転写レベルにどのように残されるかを示しています（この研究で観察されたように、説明のために、深層混合イベントは0時間で発生すると仮定しています）。）。私たちは、発現パターンは、真の概日駆動型の発現ではなく、細胞分裂と前日の産生からのリソースによって駆動されていると仮定します。この発現は、深い混合中も継続しますが、振動ごとに値が減少します。灰色のボックスは、ディールサイクルまたは深い混合により太陽光が当たらない時間を表します。深いMLに関連する積算光量の低下（細い白線で表される）は、光合成と炭素固定のより大きな経済性を必要とすることに注意してください。縦軸のスケールは、各条件 (浅い ML と妨害された ML) での相対的な発現レベルを表しており、2 つの行間で同じではない場合があります。黒い線は、この研究で採用された夜明け前のサンプリング時間を示しています。遺伝子のグループは、ML 浅化およびより高度に統合された太陽光曝露に対するそれぞれの陽性または陰性の転写反応によって色付けされます (緑色またはオレンジ色)。

層別化に対するウイルス感染の反応は分類群によって異なり、ウイルス感染の分割された連続を反映している。珪藻細胞は、ML が急速に浅くなると、緑藻よりも大きなウイルス圧力下にあるようであり、これは長期の層化によってさらに増加する可能性があります [4]。私たちのサンプル中に存在する最も豊富な珪藻属（図1D）には培養中に単離され配列決定されたウイルスが存在しないため、ウイルスの分類学的同一性は、以前に培養され配列決定されたマルナウイルス属に分類される珪藻ウイルスゲノムとの配列類似性によって推測されました[74]（補足図10)。この研究で特定された推定ウイルス配列のほとんどが、宿主の転写物も検出された非植物プランクトンウイルスグループとより密接に関連しているように見えることを考えると（補足図10、「その他」）、私たちの保守的な分析ではいくつかの新しいものを特定できなかった可能性があります珪藻に感染するウイルス。これらのウイルス転写物は、宿主転写物も検出された他の生物（例えば、海藻、節足動物、または他の動物）に感染するウイルスに由来する可能性もある（図1C、「その他」）。表層水では、3 つの珪藻ウイルスグループのうち 2 つ（マルナウイルスグループ 1 および 3）は、ML が浅くなるにつれて相対的な転写物存在量が増加しましたが、1 つは ML の浅化に応答して減少しました。 (図7)。また、地表水では、ML が浅くなるにつれて、バチコッカス属およびオストレオコッカス属内の宿主転写産物に対するウイルスの比率が減少しましたが、ミクロモナス属は変化しませんでした。すべての緑藻ウイルスは、浅いMLではウイルス：宿主転写産物比が低下しており（図7）、このグループ内のウイルス複製がこれらの条件下では刺激されなかったことを示唆しています。緑藻ウイルス：宿主比の減少は我々の仮説を裏付けており、同じ地表水中で観察された直径 100 ～ 200 nm の dsDNA 含有ウイルス濃度の減少と一致しています [4] (これには珪藻を含む ssRNA および ssDNA の検出は含まれません) 50 nm 未満のウイルス）[75、76]。細胞関連ウイルス転写物の存在/量、宿主溶解、およびウイルス粒子生成の間には時間的な遅れがあるにもかかわらず、我々のデータは、ウイルスが深いMLDと浅いMLDの間の緑藻分類群で活発に複製していないことを示しています（図7B）。翻訳された転写産物の最も近いタンパク質相同性 (補足表 3 および 4) を使用すると、この研究で使用した閾値を超えて発現された主要なキャプシドタンパク質は検出されませんでした。この観察から、深層MLDの緑藻は溶解性感染の初期段階にあるか、または溶原性/疑似溶原性状態にあるのではないかという仮説を立てます。私たちは、発現されたウイルス遺伝子の一部が、一般的な条件下で宿主の栄養素の獲得と増殖を促進していたと推測しています。たとえば、推定上のウイルスリン酸トランスポーター遺伝子は、浅いMLの上部よりも深いMLでより高く発現されました（図7）。同様の有益な機能は、エミリアニア・ハクスレイウイルスゲノムに見られるリン酸パーミアーゼトランスポーター[77]や、シアノバクテリア宿主におけるシアノファージ光化学系タンパク質発現[78]など、他のシステムでも発生する可能性があります。このメカニズムは、単一細胞の配列決定と、水塊のMLが浅くなったり深くなったりするにつれて、より高い時間分解能で長期間の時系列にわたって細胞外ウイルス産生の分子評価を使用する将来のフィールドワークでさらに評価される可能性があります。

我々の分析は、北大西洋における春の終わりの一時的な混合と浅瀬化現象の間に、異なる宿主とウイルスの遷移が短い時間スケールで発生する可能性が高いことを示唆しており、大西洋の地域における植物プランクトン群集の古典的な開花と崩壊の連続シーケンスにおけるウイルス病原体の役割を示唆している。北大西洋 [5、7、79]。珪藻や他の真核生物の植物プランクトンは、栄養欠乏や成長曲線の終わりに起こる以外の生理学的トリガーの際に溶解を示すことが示されており[74、80、81]、これは温帯ウイルスの生活環の兆候である可能性がある。実際、最近の研究では、生理学に依存した温帯動態が円石藻 (以前は厳密に溶菌性であると考えられていた) で機能していることが示されており [80]、物理的な遭遇とその制約を考慮すると、溶原性は他の真核藻類 (珪藻や緑藻を含む) で機能しているという仮説が立てられている。ウイルスによる崩壊[80]。我々は以前、栄養制限と活性酸素ストレスのバイオマーカーにより、北大西洋のブルーム期に地域内ウイルスの総蓄積量（受光域内で直径が0.05μmを超え、0.2μm未満のすべてのdsDNAウイルス）が最も高まることを示した[4]。この研究では、主要栄養素は制限されていませんでしたが（補足図2E-G）、一部のサンプルでは光が制限されており、以前のバルクコミュニティ分析に基づいて活性酸素ストレスが高かった可能性があります[4]。これらを総合すると、飽和光と活性酸素ストレスの組み合わせが珪藻群集でのウイルス溶解を引き起こす可能性があることが示唆されている。緑藻ウイルスには明らかに逆の引き金があったようです。低光量は溶解の初期段階を引き起こした可能性があるか、少なくともウイルス転写産物量の増加を引き起こした可能性があります（図7）。現在までのところ、どのような特定の環境ストレスがウイルスの複製や誘導を引き起こす可能性があるかは不明ですが、今回の結果は、ウイルスの生態に関わる重要な研究分野を浮き彫りにしています。 MLD の急速な変化や細胞内分子相互作用に対するその他の物理的要因の影響は、捕食圧力が北大西洋における毎年のブルームの発生を形作る重要な力である可能性が高いため、ウイルスの生態とブルームの進行における研究の熟した分野です[1、4]。

我々は、我々の発見に生態生理学的文脈を提供するために、ML層別化に対するトランスクリプトーム応答の門レベルの要約（図8B）を合成しました。珪藻は、浅いMLに捕捉されると、LHC：コア光合成転写産物の比率を増加させましたが、緑藻はこの比率を減少させました。炭素貯蔵に使用される同化経路（多糖類や脂肪酸の生合成など）とカルビンサイクル遺伝子は、浅いMLでは門全体で下方制御され、代わりに、急速な成長をサポートするための貯蔵資源の異化に関与する細胞経路により多く関与していました。最後に、細胞内でのウイルス複製は珪藻では全体的に増加し、緑藻では減少したが、これはMLがさらに数日または数週間層別化したままであった場合、これらの門の運命が異なっていたことを示唆している[4]。私たちのデータセットのこの門レベルの要約により、日中に強い光にさらされた珪藻と緑藻は、翌日の夜明け前にサンプリングされた場合、刷り込まれたトランスクリプトームパターンを保持しているようであることが明らかになりました（図1B、E）。例えば、植物プランクトンは、すべて日の出前に、同時に炭素異化作用遺伝子を上方制御し（図6）、コア光系遺伝子を下方制御し（図4）、他のコア光合成転写物に対するPSII転写物の比率を低下させました（図3）（図3）。 1B）。これにより、前日の統合日照量とそれに伴う細胞分裂と炭素生成が夜明け前の植物プランクトン細胞の転写状態に影響を与えるかどうかを検討することができました。

これまでの研究では、浅い安定したML内の植物プランクトンは、脂質貯蔵量が増加し始めるため、夜間にコア光系転写物を上方制御し始め、正午に最高発現に達することが示されている[30][25]（図8C）。我々は、観察されたこれらの夜明け前の発現パターンは、前日からの光の利用可能性によって確立された成長速度と分裂速度に調整されていると仮定します。このシナリオでは、細胞は十分な統合光曝露と十分な光合成出力を受け、これにより PPP および異化炭素経路が上方制御され、より高い分裂速度をサポートするのに十分な細胞の NADPH および ATP 産生が増加します。私たちは、研究初日に遭遇したような深い混合現象（MLD > 200 mまで）により、植物プランクトン群集が同様に高い細胞分裂速度を維持するには不十分な日射量を受ける結果になったと主張します。その結果、細胞は、コア光合成、炭素固定（カルビン回路）および同化エネルギー貯蔵遺伝子に関連する夜明け前の転写物のレベルを比較的高く維持し、PPPまたは異化炭素貯蔵遺伝子を増加させなかった（図8C）。この戦略により、深く混合された光不足のコミュニティが光合成と炭素固定を最大化し、深層MLでのより短い統合光曝露期間にわたって固定炭素を節約することが可能になります。このシナリオでは、エネルギー不足の集団は、コア光合成、カルビン回路、LHC、およびその他の代謝経路のために、より高い相対レベルの mRNA を維持する必要があります。これらの重要な遺伝子の mRNA レベルは、この光制限/エネルギー制限条件下では比較的高いままですが、光制限条件下でタンパク質プールを維持するためのより高いエネルギーと高分子コストは、タンパク質の代謝回転と翻訳速度の低下によって軽減される可能性があります [82, 83]。より高い時間分解能のサンプリング体制を採用した将来の研究では、この「深い破壊」概念モデルを厳密にテストし、その生態生理学的解釈をより適切に評価できる可能性があります。

私たちのメタトランスクリプトームに基づく研究は、MLD の変化に応じた、光合成、ウイルス感染、炭素循環に関連する特定の遺伝子の in situ での差次的発現についての独自の洞察を提供します。深いML状態から浅いML状態への移行は、光合成LHC転写とウイルス感染に関する多様な反応とともに、コア光合成遺伝子と炭素固定遺伝子の保存された下方制御と、それに伴う炭素異化遺伝子の上方制御を誘導した。過剰に吸収された光エネルギーの消光分子として機能するカロテノイドの生合成は、浅いMLではわずかに上方制御されるだけであり、これは単純に夜明け前のサンプリング時間を反映している可能性があるやや直観に反する観察である。私たちが観察した植物プランクトンのトランスクリプトーム応答と、以前に記録された安定したMLでのdiel発現とを比較して、深層混合イベント中の毎日の日光曝露が少ないと、毎日の炭素固定が減少し、その結果、光合成と炭素貯蔵に関連する持続的な高レベルの転写物が必要になるという仮説を立てています。このタイプのディール応答は、ML 浅化による光吸収の増加が、細胞分裂の促進をサポートする炭素異化に関連する転写の増加のシグナルとなる可能性があると主張しており、これは後の研究で検証できる概念的仮説です。まとめると、我々の研究は、一時的な物理的混合事象とそれに続く層別化に対する共有反応と発散反応の両方を反映する、珪藻および緑藻分類群を横切る光子束と炭素の流れに関連する一連の転写戦略を文書化している。

すべてのサンプルは、北大西洋エアロゾルおよび海洋生態系研究 (NAAMES) の一環として、2016 年 5 月に R/V Atlantis (AT34) で実施されたキャンペーン中に収集されました。このキャンペーンは、年間バイオマスサイクルの「クライマックス」段階を対象としていました [3、4]。。塩分と温度は、船の CTD と深度と時間間隔でのプロファイリングフロートの両方から収集されました (補足表 2)。 MLD は、他の NAAMES 研究で以前に計算されたように、Brunt-Väisālä の浮力周波数 (N2) が標準偏差よりも大きい 5 m 未満の深さとして決定されました [8、10]。

無機栄養塩濃度 (NO3、SIO4、PO4) は、このステーションについて以前に決定されています [3]。各深さと時間間隔からのサンプルは、0.8 μm ポリカーボネートフィルターを搭載したインライン 47 mm PC 濾過カートリッジを介してニスキンボトルから直接重力濾過され、滅菌 50 mL 円錐遠心分離管に入れられ、後の Lachat QuickChem QC8500 を使用した分析のために -20 °C で保存されました。ロードアイランド大学海洋科学大学院海洋科学研究施設 (GSO-MSRF) の自動イオン分析装置。

調査サイトにおける衛星由来の毎日の統合入射表面放射照度は、ステーション占有周囲の時間帯内の各日の日の出から日没までの MODIS-Aqua 衛星ブロードバンド PAR 製品 (400 ～ 700 nm) から得られました。衛星値は、ステーション 4 の NAAMES II を中心とした 2 × 2 ピクセル領域 (1 ピクセル = 250 m 解像度) にわたって平均されました。比較可能な日次積分 PAR の船上推定値は、Licor (ネブラスカ州リンカーン) モデルを使用して連続測定された放射照度から計算されました。 LI-189 コサインコレクターは船の構造による影を避けるように配置されています。サンプリング深さは、Biospherical C-OPS 放射計 (カリフォルニア州サンディエゴ) を使用して、水柱の正午近くの光学プロファイルからの相対的な表面 PAR (40%、20%、1%) から決定しました。

各深さと時間間隔（補足表 2）からの全海水サンプルを CTD Niskin ボトルに収集し、25 mm GF/F フィルター（Whatman Little Chalfont、バッキンガムシャー、英国）で真空濾過しました。フィルターは濾過後すぐに液体窒素に保管し、サンプル分析まで液体窒素または -80 °C に保管しました。高速液体クロマトグラフィーは、NASA ゴダード宇宙飛行センターで、所定の品質保証および品質管理プロトコルに従って実施されました [84、85]。

ニスキンボトルからの全海水サンプルは、真空濾過によって 47 mm、孔径 0.8 μm のポリカーボネート膜フィルター (ATTP、Millipore) 上に収集されました [4]。フィルターはサンプリング時に海上で液体窒素中で瞬間冷凍され、処理されるまで-80℃で保管されました。フィルターをドライアイス上で滅菌メスを用いて半分に切断した。半分はこの研究の RNA 抽出に使用され、残りの半分は以前のカスパーゼおよびメタカスパーゼの酵素活性アッセイに使用されました [4]。 RNAは、変更を加えずにTrizol (Invitrogen、マサチューセッツ州ウォルサム) で抽出しました。 PolyA が豊富なメッセンジャー RNA は、Rutgers Genome Cooperative の Invitrogen SuperScript II Reverse Transcriptase を使用して逆転写されました。この cDNA からライブラリーを調製し (TruSeq RNA Library Prep Kit v2. Illumina、サンディエゴ、カリフォルニア州)、ニュージャージー州エジソンの Genscript で HiSeq システム (Illumina) を使用して 2 × 150 塩基対で配列決定しました。

すべてのサンプルからの生のリードは、CLC Genomic Workbench (バージョン 20.0.4、長さの割合 = 0.8、類似性の割合 = 0.9、一意にマッピングされたリードのみ) を使用してトリミングされたシーケンシングアダプターと低品質のヌクレオチドを検索されました [86]。トリミングされたリードは Trinity (バージョン 2.12.0) [87] を使用してアセンブルされ、11,046,104 個のコンティグが得られました。メタトランスクリプトームアセンブリ内のタンパク質コード領域は、TransDecoder を使用して予測されました [88]。メタトランスクリプトームの冗長性を減らすために、予測されたコード領域は CD-HIT [89] を使用して 95% の同一性でクラスター化され、2,053,751 個の配列が得られました。各サンプルからトリミングされたリードは、CLC Workbench を使用してアセンブリにマッピングされ、一意にマッピングされたリードのみがカウントされました。すべてのサンプルにわたってマップされたリードの合計が 50 未満のコンティグが除外され、その結果 673,142 個のコンティグが下流分析に使用されました。機能的アノテーションは、EggNOG [90]を使用して特定されました。

各コンティグに分類学的識別を割り当てるために、以下を組み込んだカスタムのローカルタンパク質データベースが使用されました。 MetaEuk [93] によって識別された分類学的識別子を持つタラ海洋コンティグからの遺伝子。マトウ [45]; および Uniref100 (2020 年 5 月更新) データベース。タンパク質は DIAMOND (v. 2.0.11、超高感度モード) でアラインメントされました [94]。 50 のビットスコアカットオフが使用されました。このカスタムデータベースの各アライメントの上位ビットスコアに割り当てられた系統発生は、さらなる分析のために保存されました。タンパク質配列が複数の藻類門にマッピングされている場合、コンティグが複数の系統発生門から組み立てられている可能性がある場合、各門の 1 つのヒットが保持されます。

上位 20 の代表的な属は、サンプルごとの 100 万あたりの合計転写産物 (TPM) に基づいて決定されました。 TPMは、各転写産物の読み取り数を推定上の遺伝子長（キロベース単位）で割ることによって計算されました（キロベースあたりの読み取り数）。キロベースあたりのすべての読み取りを各サンプルで合計し、1,000,000 で割ってスケーリング係数を求めました。キロベースあたりの読み取り数を各サンプルのスケーリング係数で割って、各読み取りおよびサンプルに対応する TPM を取得しました。

転写物は、生のカウントを DESeq2 [95] (バージョン 1.28.1) に渡す前に、属レベルでグループ化されました。これは、サンプリング日の間に 1 つの分類グループのバイオマスが増加したり、細胞あたりの mRNA の発現量が増加したりする影響を補正するためです。これは、上方制御される遺伝子と下方制御される遺伝子の量を歪めることが示されている[96]。 DESeq2 を使用して、遺伝子が大幅に変化したかどうかを判定しました (偽発見率/FDR 調整後の p 値 < 0.001 および log2 倍変化 > |1|)。 3 つの比較グループを使用して、深く混合された層内の遺伝子発現の有意な変化を検索しました。浅い混合層内。深い混合層と浅い混合層のそれぞれの深さの間（図1F）。 DESeq2 からの正規化された読み取り値を使用して、大幅に変更された遺伝子のサブセットからヒートマップを作成しました (図 2、4、5、6、および 8)。

EGGNOG によって生成された予測 KEGG 用語を使用して、機能遺伝子に属ごとに注釈を付けました。光合成 (ko00195)、カロテノイド生合成 (ko00906)、および光合成 LHC タンパク質 (ko00196) の参照経路を、他の研究論文から入手したオキシダント消去タンパク質のカスタムセットとともに使用しました [14、74]。 3 つの比較カテゴリーのうち少なくとも 1 つで有意に変化した遺伝子 (調整後の p 値 <0.001 および log2 倍率変化 > |1|) のみを、MLD に関連する重要な遺伝子経路の発現解析に使用しました (図 2、4、5)。、6および補足図9）、すべての遺伝子が大幅に変化した主要な遺伝子の割合の分析に含まれました（補足図4、7、および8）。

珪藻の集光複合タンパク質を表す KEGG 用語は機能的多様性を反映していません (つまり、LHCA1 は多くの珪藻タンパク質に注釈が付けられています) が、その多様性はフコキサンチン-クロロフィルタンパク質 (FCP) と呼ばれる密接に関連したタンパク質のグループによく反映されています。私たちのデータセット内の珪藻 FCP を識別するには、熊澤らによる文献で見つかった FCP タンパク質の各クラスを使用します。 [50] (LHCX、LHCF、LHCR、LHCQ、LHCZ) は最初に UniProt からダウンロードされました。各タンパク質クラスから HMMprofile (HMMer バージョン 3.3) が構築され、続いて HMMsearch によって珪藻コンティグ内で一致するものを見つけました。 50 未満のビットスコアは削除されました。 IQTree (バージョン 1.6.12、ModelFinder Plus、1000 ブートストラップ複製および bnni オプション、BIC に従って選択されたモデル VT + R8) を使用して、以前にアノテーションを付けたタンパク質とともにこれらの配列を整列させました。 FCPタンパク質の対応するグループは、ツリー内のそれぞれのグループ系統発生に基づいて決定されました（補足図3）。

異化および同化貯蔵分子反応を決定するには、デンプンおよびスクロース代謝 (ko00500) KEGG 経路、ならびにグリコーゲン生合成 (M00854) および分解 (M00855) モジュールとして注釈が付けられた遺伝子を使用します。 KEGG 反応を使用して、各用語の同化または異化の性質を決定しました。反応の曖昧な方向性は、必要に応じてラベル付けされました（補足図9）。

珪藻ウイルスは、Kranzlerらと同様のRNA依存性RNAポリメラーゼから構築されたカスタムデータベースを備えたHMMER HMMscanを使用して同定されました。 [74]。ビットスコア 50 がカットオフとして使用されました。上位属のほとんどを構成する培養代表由来のウイルスは培養下で分離されていないため、RDRP 配列の ClustalW アラインメントを使用して系統樹を構築し、本研究で検出されたウイルスと配列決定されたウイルスグループとの関係を確認しました。 RAxML Web サーバー [97] は、このツリーを構築し、ブートストラップサポート値 (モデル = WAG + F + G4、ブートストラップ = 100) を提供するために使用されました。さまざまなコンティグと遺伝子の長さを含む私たちの読み取りは、GUPPY の (https://bio.tools/guppy) と pplacer [98] (v 1.1 alpha19) を使用して組み込まれました (補足図 10)。核細胞質ウイルスコンティグ (緑藻ウイルス) を PfamScan (カットオフ値 < 0.001) でアラインメントして、推定上の機能と最も近いドメインまたはファミリーを決定しました。有意なアラインメントを有する同じコンティグ上の各ドメインが報告されました。 PfamScan に一致しないコンティグを NCBI (BLASTp) に対してブラストし、トップヒットに基づいて推定機能を推測しました (補足表 3)。

私たちの研究で分析されたほとんどの珪藻グループにはデータベースで表される培養ウイルスが存在しないため、広範な珪藻感染指標を得るために、総ウイルス TPM をサンプルあたりの総珪藻 TPM で割った (Kranzler et al. と同様) [74]。培養された代表的な緑藻ウイルスのゲノムが公開されているため、検出されたプラシノウイルス転写産物の各タイプ (ミクロモナスウイルス、オストレオコッカスウイルス、バチコッカスウイルス) からの TPM の合計を、サンプルごとの各宿主属の TPM で割りました。

この転写物で使用される生の配列データは、翻訳されたアミノ酸配列、各遺伝子 ID およびサンプルの TPM とともに、NCBI BioProject PRJNA859122 (GEO Accession GSE208287) で入手できます。このステーションおよび NAAMES 全体からのフロースルーおよび CTD キャストからの HPLC およびその他のメタデータは、NASA の SEABASS Earthdata リポジトリ https://seabass.gsfc.nasa.gov/search#bio で公開されています。裏付けデータ 1 には、ミヌートセルス属、エクストボセルルス属、フラギラリオプシス属、チャエトセロス属、タラシオシラ属、ミクロモナス属、バティコッカス属、およびオストレオコッカス属に属すると判定されたすべての配列の翻訳されたアミノ酸配列が含まれています。裏付けデータ 2 には、この研究で使用された比較に関連する倍率変化と調整された p 値 (大幅に変化したかどうか)、および前述の 8 つの属への分類学的注釈が含まれています。裏付けデータ 3 には、この研究で検出されたすべての遺伝子 (前述の植物プランクトンの上位 8 属のいずれかとして特定されなかった遺伝子を含む) のカウント行列が含まれており、サンプル番号でラベルが付けられています (図 1A)。裏付けデータ 4 には、この研究で分析された 8 つの植物プランクトン属の転写産物の遺伝子 ID と、EGGNOG によって決定された最も近い Kegg 用語の一致 (存在する場合) が含まれています。裏付けデータ 5 には、この研究で特定された遺伝子 ID、翻訳されたアミノ酸配列、および LHC タイプが含まれています (KEGG によって注釈が付けられていないものを含みます。「方法」を参照)。

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記事 Google Scholar

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この研究は、北大西洋エアロゾルおよび海洋生態系研究 (15-RRNES15-0011 および 80NSSC18K1563 から KB、NNX15AF30G から MB、および NNX15AE70G から KH)、ゴードンおよびベティムーア財団 ( KB への賞 #3789）、NSF の総合活動局（KB への OIA-2021032 の助成）、および NASA の宇宙科学技術における将来の研究者プログラム（FINESST; 助成 #826380; BD への卒業生サポート）。私たちは、NAAMES 遠征中の現場サンプルとデータの収集、処理、分析を支援する上でのたゆまぬ努力と役割に対して、クリスティアン・ラバー氏、ベン・ノウルズ氏、クリス・ジョンズ氏、エリザベス・ハーベイ氏、そしてR/Vアトランティスの船長と乗組員に感謝します。。また、この研究の指針となった洞察力に富んだ会話とアイデアを提供してくれた Kim Thamtrakoln、Austin Grubb、Chris Johns にも感謝します。

ベン・P・ディアス

現在の住所: Biotechnology & Bioengineering、Sandia National Laboratories、7011 East Avenue、Livermore、CA、94550、USA

ラトガース大学海洋沿岸科学部、ニューブランズウィック、ニュージャージー州、08901、米国

ベン・P・ディアス＆ケイ・D・ビドル

ラトガース大学先端研究コンピューティング局、ピスカタウェイ、ニュージャージー州、08854、米国

エフド・ゼルジオン

オレゴン州立大学微生物学部、コーバリス、オレゴン州、97331、米国

キンバリー・ハルシー

応用物理学研究所、ワシントン大学、シアトル、ワシントン州、98105、米国

ピーター・ゴーブ

オレゴン州立大学植物学および植物病理学部門、コーバリス、オレゴン州、97331、米国

マイケル・ベーレンフェルト

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BD は原稿を書き、トランスクリプトームデータを分析し、配列決定用のサンプルを準備しました。 EZ はトランスクリプトームデータを分析し、原稿を編集しました。 KH、PG、MB が原稿を編集し、概念化に貢献しました。 MB は、2016 年 5 月にサンプルが採取された NAAMES 遠征の主任科学者でした。KB はフィールドワークと実験計画を考案し、原稿を編集し、研究に資金を提供しました。

ケイ・D・ビドルへの通信。

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転載と許可

Diaz、BP、Zelzion、E.、Halsey、K. 他。海洋植物プランクトンは、混合層が急速に浅くなると、コアとなる光合成遺伝子と炭素貯蔵遺伝子を下方制御します。 ISME J (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41396-023-01416-x

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受信日: 2022 年 7 月 14 日

改訂日: 2023 年 4 月 3 日

受理日: 2023 年 4 月 13 日

公開日: 2023 年 5 月 8 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-023-01416-x

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海洋植物プランクトンは、混合層が急速に浅くなるとコア光合成遺伝子と炭素貯蔵遺伝子を下方制御する